藥品是特殊商品，關(guān)系到人們的生命安全?！端幤飞a(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》 ( good manufacturing practice，GMP) 2010 年修訂附錄1無菌藥品第三條指出：“無菌藥品的生產(chǎn)必須嚴(yán)格按照精心設(shè)計(jì)并經(jīng)驗(yàn)證的方法及規(guī)程進(jìn)行，產(chǎn)品的無菌或其他質(zhì)量特性，決不能依賴于任何形式的最終處理或成品檢驗(yàn) (包括無菌檢查) ”。筆者從無菌制劑的特殊性、無菌檢查方法的局限性、無菌保證水平、無菌產(chǎn)品的工藝設(shè)計(jì)、無菌安全的保證要素幾個(gè)方面探討提高無菌安全水平的對策，以完善產(chǎn)品的質(zhì)量保證體系，保證藥品的質(zhì)量、療效和用藥安全。

  無菌制劑的特殊性

  無菌物品是指物品中不含任何活的微生物， 實(shí)際上無法證明產(chǎn)品中沒有活的微生物存在， 因?yàn)閷τ谌魏我慌鷾缇锲范裕?絕對無菌既無法保證也無法用實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。一批物品的無菌特性只能通過對物品中活的微生物的概率低至某個(gè)可接受的水平來表達(dá)， 即無菌保證水平 ( sterility assurance level， SAL) 。實(shí)際生產(chǎn)過程中，滅菌是指將物品中污染的微生物概率降至預(yù)期的無菌保證水平。最終滅菌物品微生物存活概率，即無菌保證水平不得高于 10-6。無菌制劑的生產(chǎn)是一個(gè)完整的操作規(guī)則體系， 若其中的任何環(huán)節(jié)被疏忽、 被污染，那么其他環(huán)節(jié)雖是無菌操作， 也將完全失去意義，都可能導(dǎo)致藥品生產(chǎn)不符合質(zhì)量要求。

  無菌檢查法的局限性

  無菌檢查法是根據(jù)《中華人民共和國藥典》 內(nèi)容而建立的一種檢查方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。檢驗(yàn)結(jié)果只是基于“可能性” 的判斷 ， 無菌檢查方法的局限性在于以下幾個(gè)方面。

  1培養(yǎng)液的質(zhì)量

  無菌檢查所用的培養(yǎng)液只是針對真菌和細(xì)菌的檢驗(yàn)， 對結(jié)果的判斷也是基于“是否在培養(yǎng)液中生長”。

  2培養(yǎng)條件

  研究表明，《中華人民共和國藥典》 規(guī)定的微生物培養(yǎng)條件并不是許多細(xì)菌和真菌的最適生長條件 。

  3實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

  微生物的生長除了受培養(yǎng)液的質(zhì)量、培養(yǎng)條件( 溫度、時(shí)間) ， 還要受檢品特性如檢品有無抑菌作用、 供試品的處理方法及實(shí)驗(yàn)操作條件等因素的影響，因此要保證無菌檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性就必須對無菌檢查的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

  4檢驗(yàn)數(shù)量

  《中華人民共和國藥典》 規(guī)定無菌檢查是抽樣檢查，一般是從每批產(chǎn)品中抽取一定數(shù)量的單位產(chǎn)品組成樣本進(jìn)行無菌檢查， 以此判斷整批產(chǎn)品是否符合無菌的要求。無菌產(chǎn)品的污染率(q) 、 無菌檢查的取樣量(n) 以及無菌檢查通過的概率( p) 之間的關(guān)系可以用如下數(shù)學(xué)公式表示: pn = (1-q) n。當(dāng)固定污染率為 0.1%，抽樣 30 瓶時(shí)通過無菌檢查的通過率為( 1-0.001) 30 = 97.0%， 檢出染菌的概率為3.0%; 抽樣 100 瓶時(shí)， 通過無菌檢查的通過率為( 1-0.001) 100 = 90.5%， 檢出染菌的概率為 9.5%; 抽樣1 000瓶時(shí)，通過無菌檢查的通過率為(1-0.001) 1.000 = 36.8%，檢出染菌的概率為 63.2%。

  當(dāng)固定 30 瓶取樣量， 假定該產(chǎn)品的污染率為 1.0%，通過計(jì)算，該批產(chǎn)品通過無菌檢查的通過率為 74%; 如果該產(chǎn)品的污染率為 0.5%，則通過無菌檢查的通過率為 86%。通過以上數(shù)據(jù)可以看出: 樣本污染微生物的比例越低， 抽樣樣本通過無菌檢查的通過率就越高，即使增大抽樣量也很難檢查出污染的部分。因?yàn)闊o菌檢查法是一項(xiàng)破壞性實(shí)驗(yàn)，因此不可能對整批產(chǎn)品進(jìn)行 100%的檢驗(yàn)，基于抽樣檢驗(yàn)的無菌檢查，存在的局限性是很明顯的。雖然產(chǎn)品的無菌檢查按《中華人民共和國藥典》 規(guī)定檢查合格，但不能得出產(chǎn)品絕對無菌的結(jié)論，這已是一個(gè)共識。

  無菌保證水平

  2010 版《中華人民共和國藥典》 將終端產(chǎn)品的無菌保證要求規(guī)定為微生物污染概率不超過百萬分之一，而采用無菌制造工藝，其無菌保證水平則為微生物污染概率不超過千分之一。以過濾除菌法為例。過濾除菌法：常用于氣體 熱不穩(wěn)定的藥品液體或原料的除菌。

  過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負(fù)荷及過 濾器的對數(shù)下降值 ( log reduction value，LRV) 有關(guān)，LRV 系指規(guī)定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對數(shù)值。即: LRV = LgN0-LgN。式中: N0 為產(chǎn)品過濾前的微生物數(shù)量，N為產(chǎn)品過濾后的微生物數(shù)量。每平方厘米有效過濾面積的 LRV 可以達(dá)到 7， 即過濾器上游每平方厘米有107個(gè)菌，下游可以達(dá)到 1個(gè)菌的水平。

  除菌過濾器本身的除菌效率可以達(dá)到10-7水平，但是，由于人員操作及環(huán)境因素的影響， 產(chǎn)品最終的無菌保證一般只能達(dá)到10-3 水平， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于除菌過濾本身的水平。此外除菌過濾器不能將病毒或支原體全部濾除，所以對于除菌過濾法，其生產(chǎn)系統(tǒng)應(yīng)嚴(yán)格符合無菌生產(chǎn)的 GMP 要求。GMP2010 年修訂附錄 1無菌藥品第五十二條: 應(yīng)當(dāng)盡可能減少物料的微生物污染程度。

  第五十八條: 應(yīng)當(dāng)根據(jù)所用滅菌方法的效果，確定滅菌前產(chǎn)品微生物污染水平的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，并且定期監(jiān)控。因此《藥品 GMP 指南》 ( 無菌藥品，2010 年修訂) 在第 6 節(jié)藥液的配制中提出: 對于固體溶解并進(jìn)行無菌過濾的產(chǎn)品而言， 起始物料的微生物污染水平應(yīng)進(jìn)行控制，通常為100 cfu·g-1[菌落形成單位數(shù)(colony forming units，cfu)]，除菌過濾前非最終滅菌產(chǎn)品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)一般為 10 cfu /100 mL。

  無菌產(chǎn)品的工藝設(shè)計(jì)

  無菌生產(chǎn)工藝就是必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌產(chǎn)品分兩大類即無菌分裝的產(chǎn)品和最終滅菌的產(chǎn)品。無論是哪一類無菌產(chǎn)品， 無菌生產(chǎn)工藝都應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度， 并應(yīng)在無菌控制的環(huán)境下才能操作。采用無菌生產(chǎn)工藝， 首先在劑型的選擇上應(yīng)選擇無菌保證水平高的劑型。如果主藥在水中穩(wěn)定，但不能耐受濕熱滅菌，則不宜開發(fā)成大容量注射劑，可以開發(fā)成小容量注射劑或凍干粉針，因?yàn)椴捎脽o菌生產(chǎn)工藝制備大容量注射劑因灌裝時(shí)間長，染菌的風(fēng)險(xiǎn)就大大提高。在其生產(chǎn)過程中，應(yīng)定期對無菌生產(chǎn)工藝進(jìn)行驗(yàn)證， 驗(yàn)證內(nèi)容包括環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性、工藝用水系統(tǒng)、設(shè)備和人員清潔及培養(yǎng)液模擬灌裝實(shí)驗(yàn)等。

  無菌安全的保證要素

  無菌安全實(shí)際上就是避免染菌， 如果在生產(chǎn)過程中能避免已滅菌的容器設(shè)備等受到二次污染就能保證產(chǎn)品的無菌安全。微生物的來源主要有以下 3 種。

  1人員

  人是潔凈區(qū)環(huán)境的最大污染源， 因?yàn)槿藛T幾乎涉及到所有的生產(chǎn)步驟，人員的活動(dòng)量將直接影響整個(gè)潔凈區(qū)的環(huán)境質(zhì)量，在無菌室由操作人員引起的污染將達(dá)到總污染原因的 95% 。研究表明，潔凈室內(nèi)的工作人員穿無菌服時(shí)，靜止?fàn)顟B(tài)的發(fā)菌量一般為每人每分鐘 10 ～ 300 個(gè)， 軀體一般活動(dòng)狀態(tài)為每人每分鐘150～1 000 個(gè)，快步行走狀態(tài)為每人每分鐘 900 ～ 2 500個(gè)，咳嗽一次一般為每人每分鐘 70～700 個(gè)，噴嚏一次一般為每人每分鐘 4 000 ～ 62 000 個(gè)。通過對上海地區(qū)無菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的核心生產(chǎn)區(qū)( 即動(dòng)態(tài) A /B 或 A /C級) 環(huán)境中微生物的污染采樣，共收集到微生物分離株265 株，A 級區(qū)共收集到 63 株， 占污染微生物總數(shù)的23.8%，在 A 級區(qū)的微生物污染物類型較多、 較復(fù)雜。不同潔凈級別區(qū)域之間的空氣微生物污染程度由低級別向高級別遞減，但表面微生物污染程度在各潔凈級別之間的差異不大。這說明空氣凈化和物理隔離可以有效阻斷大部分微生物的傳播，但接觸和操作引起的污染仍是生產(chǎn)企業(yè)面臨的主要問題。

  2工藝用水

  注射用水與注射劑在生產(chǎn)過程中污染可能性最高的發(fā)熱性物質(zhì)就是細(xì)菌內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素由革蘭陰性菌產(chǎn)生， 而水源性微生物絕大多數(shù)為革蘭陰性菌，這類微生物不會(huì)形成芽孢， 故不耐熱， 通過滅菌手段可將其殺死， 但該類細(xì)菌的細(xì)胞壁外層上有一層特殊的結(jié)構(gòu)， 它在細(xì)菌生長繁殖過程中并不分泌到介質(zhì)中，也不能從外壁上自然脫落，不是細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)菌死亡、解體后才顯示出一系列內(nèi)毒素的生物活性。細(xì)菌內(nèi)毒素具有耐熱性， 需用干熱滅菌(250 ℃，30min 以上)才能去除。細(xì)菌內(nèi)毒素會(huì)使人致病甚至死亡，對藥品質(zhì)量產(chǎn)生不良的影響。

  3環(huán)境

  空氣中的微生物基本為革蘭陽性菌，根據(jù)有關(guān)的資料報(bào)道 : 人葡萄球菌和唾液鏈球菌為人體攜帶的常見菌種，而沃氏葡萄球菌、藤黃微球菌和芽孢桿菌均為常見環(huán)境菌。產(chǎn)生芽孢的細(xì)菌都是革蘭陽性菌 ，芽孢對熱、干燥、輻射、化學(xué)、消毒劑等理化因素均有強(qiáng)大的抵抗力，其中含有吡啶二羧酸鈣，更增加了對熱的抵抗力。如果芽孢被環(huán)境中的塵埃包圍， 這類芽孢的耐熱性可能會(huì)更強(qiáng)，更不易被殺死。

  提高無菌安全水平的對策

  1重視無菌檢查法的方法學(xué)驗(yàn)證

  無菌檢查法常見的問題： 對檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證、 培養(yǎng)時(shí)間的選擇和結(jié)果判斷缺乏系統(tǒng)的評價(jià)。所以，應(yīng)綜合分析實(shí)驗(yàn)中遇到的所有情況，最終形成一份詳細(xì)的、嚴(yán)謹(jǐn)、具有可操作性的驗(yàn)證報(bào)告，并且建立該品種的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程( standard operation procedure， SOP) ，在規(guī)程中應(yīng)對樣品的取樣量、無菌檢查方法的選擇、集菌培養(yǎng)器的型號、稀釋劑及沖洗液的選擇、每次沖洗液的用量和沖洗次數(shù)都應(yīng)有說明。研究表明， 同一品種使用適于抗菌性供試品專用培養(yǎng)器( KSF330， 0.45 μm) 比使用適于非抗菌性供試品普通培養(yǎng)器 ( CN330， 0.22 μm;PY330，0.45 μm) 所需沖洗量少一半; 不同的品種所需的沖洗量不同，選擇不同的沖洗液所需的沖洗量不同。對待無菌檢查結(jié)果要進(jìn)行科學(xué)分析， 如果無菌檢查結(jié)果合格，不能得出該批產(chǎn)品絕對無菌的結(jié)論，如果無菌檢查不合格，則可以判定該批產(chǎn)品染菌的結(jié)論。不能出現(xiàn)假陰性( 陽性對照為陰性) 時(shí)漏檢， 當(dāng)結(jié)果為陽性時(shí)，違反《中華人民共和國藥典》 規(guī)定進(jìn)行復(fù)檢。

  2全面、細(xì)致、周到的質(zhì)量管理

  目前已經(jīng)過了 GMP認(rèn)證的無菌制劑生產(chǎn)企業(yè)，均建立了完善的質(zhì)量管理體系和一系列管理制度。但任何一項(xiàng)規(guī)章制度都無法阻止違規(guī)現(xiàn)象的發(fā)生，能否有效執(zhí)行是關(guān)鍵。在生產(chǎn)中可能會(huì)出現(xiàn)很多違規(guī)現(xiàn)象，但是在管理方面卻沒有任何的證據(jù)。例如對傳遞窗使用的管理，傳遞窗的作用就是防止物品在傳遞過程中受到污染和避免交叉污染，對傳遞窗的使用有幾個(gè)要求: 傳遞窗的自凈時(shí)間、 紫外線的照度及照射時(shí)間。而現(xiàn)在多數(shù)的傳遞窗的按鈕設(shè)置就是一個(gè)最基本的電源開關(guān)，工作人員自行操作時(shí)會(huì)嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行嗎? 如自凈時(shí)間確認(rèn)為30 min，有些操作人員為了趕時(shí)間， 只用15 min。再例如， 對于無菌操作間，進(jìn)入人員的數(shù)量是有嚴(yán)格規(guī)定的， 但有時(shí)車間為了趕進(jìn)度或由于其他原因可能會(huì)增加人數(shù)，這些操作都是違規(guī)的，所以為了能全面、細(xì)致、周到地執(zhí)行和實(shí)施GMP，建議從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。

  人員培訓(xùn)

  GMP 培訓(xùn)是提高藥品生產(chǎn)企業(yè)人員素質(zhì)的有效手段， 人員素質(zhì)的不斷提高是保證藥品質(zhì)量的基礎(chǔ)。應(yīng)對員工開展各類培訓(xùn)， 對不同員工所在崗位需要掌握的知識和技能進(jìn)行針對性培訓(xùn)， 對培訓(xùn)效果進(jìn)行考核。保障員工掌握本崗位的基本理論知識、 操作規(guī)程和實(shí)際操作技能。同時(shí)，要經(jīng)常對員工進(jìn)行藥害事件的宣傳教育工作，增強(qiáng)責(zé)任心，使其在工作中自覺地按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作 。無菌藥品的微生物污染是影響藥品生產(chǎn)質(zhì)量和引發(fā)不良反應(yīng)事件的主要因素之一。微生物是無處不在、 無孔不入的， 反復(fù)進(jìn)行無菌概念的培訓(xùn)是加強(qiáng)無菌概念的有效辦法。反思現(xiàn)行的無菌培訓(xùn)， 內(nèi)容多是微生物學(xué)和進(jìn)出潔凈室的規(guī)程，由于操作規(guī)程中不可能事無巨細(xì)，員工在實(shí)際生產(chǎn)中遇到規(guī)程中沒有規(guī)定的情況， 常常會(huì)違反無菌操作的原則[ 11] 。特別要加強(qiáng)對外部施工人員和維修人員的培訓(xùn)工作， 當(dāng)他們在生產(chǎn)期間需進(jìn)入生產(chǎn)潔凈區(qū)時(shí)應(yīng)當(dāng)對其進(jìn)行詳細(xì)的指導(dǎo)和監(jiān)督。在實(shí)際生產(chǎn)中，往往會(huì)出現(xiàn)這樣的情況， 當(dāng)設(shè)備出現(xiàn)小故障時(shí)， 為了使生產(chǎn)能正常進(jìn)行，或者出于迫切完成任務(wù)的考慮，維修人員會(huì)做出一些違規(guī)動(dòng)作， 如果沒有較強(qiáng)的無菌

  概念，就會(huì)導(dǎo)致污染。

  工藝用水

  有效控制水系統(tǒng)的微生物污染水平及細(xì)菌內(nèi)毒素的水平， 企業(yè)內(nèi)部應(yīng)設(shè)立警戒水平及糾偏限度，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)不良趨勢，采取相應(yīng)措施。

  環(huán)境管理

  環(huán)境管理的主要思想是防止污染和交叉污染。生產(chǎn)環(huán)境包括: 空氣、 設(shè)備、 設(shè)施以及操作人員。環(huán)境監(jiān)測是用來評估生產(chǎn)環(huán)境控制是否有效的一個(gè)工具。檢測項(xiàng)目包括懸浮粒子、 空氣浮游菌、 沉降菌、 設(shè)備和設(shè)施表面的微生物以及操作人員的衛(wèi)生狀況監(jiān)測等。環(huán)境中懸浮粒子的有效控制， 在很大程度上解除了塵埃包裹芽孢的可能， 避免了難以滅菌的風(fēng)險(xiǎn)。沉降菌、 浮游菌及表面微生物這 3 種監(jiān)測的原理是不同的，針對不同的微生物， 不能完全相互替代。通過對潔凈室 /區(qū)空氣、 設(shè)備、 設(shè)施表面以及操作人員表面微生物的采集， 除了通過菌落計(jì)數(shù)了解微生物的濃度外，還應(yīng)包括對培養(yǎng)出來的污染微生物進(jìn)行鑒別，通過鑒別可了解潔凈室的清潔、 消毒步驟的有效性或缺陷性，特別是對消毒劑有效性評估有所幫助，微生物鑒別的結(jié)果也對調(diào)查和消除污染源有幫助。

  設(shè)備的管理

  在企業(yè)的生產(chǎn)過程中，設(shè)備與設(shè)施如同戰(zhàn)場上的武器一樣，平時(shí)必須要注重保養(yǎng)和維護(hù)，并且要制定有效的短、 中期維修計(jì)劃，確保設(shè)備正常運(yùn)行，這樣才能在實(shí)際操作中發(fā)揮良好的作用，不會(huì)給生產(chǎn)帶來負(fù)面影響。

  3注重?zé)o菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證

  要定期進(jìn)行培養(yǎng)液模擬灌裝驗(yàn)證，證明經(jīng)過完整的生產(chǎn)過程，產(chǎn)品污染率的目標(biāo)為零。培養(yǎng)液模擬灌裝在某種意義上是一種挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，使用培養(yǎng)液作為藥品的替代品進(jìn)行無菌模擬生產(chǎn)，對無菌工藝進(jìn)行驗(yàn)證。因?yàn)閹缀踉谒星闆r下，微生物在培養(yǎng)液中的繁殖和生長比在實(shí)際產(chǎn)品中更容易。GMP( 2010 年修訂) 附錄 1 無菌藥品中第四十七條提出: 培養(yǎng)液模擬灌裝實(shí)驗(yàn)的首次驗(yàn)證，每班次應(yīng)當(dāng)連續(xù)進(jìn)行 3 次合格實(shí)驗(yàn)， 空氣凈化系統(tǒng)、 設(shè)備、 生產(chǎn)工藝及人員重大變更后，應(yīng)當(dāng)重復(fù)進(jìn)行培養(yǎng)液模擬灌裝實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)液模擬灌裝實(shí)驗(yàn)通常應(yīng)當(dāng)按照生產(chǎn)工藝每班次半年進(jìn)行一次，每次至少一批。

  4現(xiàn)場監(jiān)督

  現(xiàn)場監(jiān)督是質(zhì)量保證(quality assurance，QA) 的一部分。QA就是為了滿足品質(zhì)的要求而進(jìn)行的全面有效的質(zhì)量管理活動(dòng)。QA人員的主要職責(zé)就是對生產(chǎn)全過程進(jìn)行控制， 糾正生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的差錯(cuò)及不規(guī)范行為， 做到防患于未然。QA人員工作的性質(zhì)就是要找別人的缺點(diǎn)與不足，為了起到警示作用還必須對不規(guī)范行為進(jìn)行扣罰。QA人員最容易犯的錯(cuò)誤就是遇見問題總是搬出文件規(guī)定，命令操作人員執(zhí)行，當(dāng)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)異常情況時(shí)也只會(huì)讓操作人員停下來并且一味強(qiáng)調(diào)要如何處分或者威脅當(dāng)事人，這樣說和做的結(jié)果不僅不能解決問題，反而會(huì)增加當(dāng)事人對QA人員的反感， 以后 QA人員的管理工作會(huì)更難開展。

  更可怕的是操作人員會(huì)有意隱瞞生產(chǎn)現(xiàn)場的任何問題， 這樣一來質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)會(huì)越來越大。GMP 規(guī)范和《中國人民共和國藥典》的標(biāo)準(zhǔn)是不可逾越的，為此需要尋找各種可行的辦法， 所以要求 QA人員必須具有理論知識和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，既精通GMP法規(guī)，熟知生產(chǎn)工藝，又要懂得設(shè)備的操作，并且還要具有良好的與人溝通的能力。在現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)問題時(shí)，QA人員能和操作人員共同分析問題， 從根本上幫助操作人員解決問題， 得到操作人員的理解和尊重，這樣才能使QA工作進(jìn)入良性循環(huán)。